本课题组常年全球招募具有化学、材料、生物和医学等相关背景的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理
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sjtu.edu.cn背景介绍荧光显微技术已广泛应用于mRNA成像、材料表征、病理诊断等领域中，以获取细胞、组织内的分子分布与结构信息，其样品制备简单，对设备要求较低。然而，由于光的衍射，传统荧光显微镜的分辨率通常仅在00nm左右。近年来，超分辨显微镜的发展，可将成像分辨率提高至30-50nm，而其价格昂贵、需要特定硬件与复杂数据处理过程限制了其广泛应用。膨胀显微镜（ExM）则通过在成相前对生物样品进行物理扩展来提高常规显微镜的分辨率至70nm左右，但仍低于超分辨显微镜。
日前，来自上海交通大学的丁显廷团队提出了一种九倍膨胀（NIFS）水凝胶，用于常规传统显微镜下的核孔复合物、网格蛋白涂层凹坑等细胞超微结构成像，可将分辨率降至31nm。同时，作者设计了一款可拆卸的芯片，集成细胞培养、固定、染色、锚定和凝胶化等一系列样品前处理过程，最大程度地提高该高分辨成像技术的可重现性，为超分辨成像提供了通用平台。相关工作以“Expansionmicroscopywithninefoldswelling(NIFS)hydrogelpermitscellularultrastructureimagingonconventionalmicroscope”为题发表于ScienceAdvances。
文章内容在该项研究中，作者首先利用聚合物链分子（含丙烯酸钠SA、丙烯酰胺AA）与交联剂EBIS制备得到水凝胶。该凝胶具有良好的生物相容性与透光性，更重要的是，具备79（93）倍的各向同性膨胀性能。该凝胶用于膨胀显微镜（ExM）技术的步骤包括：固定染色、锚定、凝胶化、膨胀等（图1A），这一系列过程可被集成于自制的简易芯片（图1C）。具体来看，生物样品经固定、染色后，由锚定剂（MA-NHS）处理并在其细胞膜表面蛋白上连接甲基丙烯酰基，生物样品与AA/SA聚合物链、交联剂EBIS混合后，经连接反应被锚定至聚合物三维网络中。消化缓冲液可使细胞结构发生松散、机械均质化，随后随着水凝胶的各向同性膨胀，细胞均匀放大而不变形，便可在常规显微镜下进行超微结构的观察。
图1NIFS水凝胶用于膨胀显微镜示意图
紧接着，作者将生物样本嵌入到水凝胶，并从宏观、微观、纳米三个尺度上测试NIFS水凝胶的膨胀能力（图A）。首先从宏观尺度上，作者利用不对称的梯形水凝胶评估了其膨胀均匀性和膨胀系数（图B-D）。研究发现，水凝胶的两侧比值（L1/L3）在膨胀过程中几乎不变化，也不随交联剂浓度的改变而改变，因此认为水凝胶的膨胀是各向同性的。此外，作者探究发现水凝胶的膨胀系数（L1’/L1）随着交联剂浓度的降低而增加。随后，作者在微观尺度以细胞核距离变化（图E-G）、在纳米尺度以微管结构的匹配算法（图H-M）分别探究了ExM的膨胀性能，均得出了与宏观尺度一致的结论。具体地，作者研究发现在膨胀过程中，两两细胞核之间的距离变化一致，且膨胀系数不受细胞密度影响。此外，对沿垂直于微管方向的参考线的荧光强度分布进行分析，其半峰宽（FWHM）随着交联剂浓度降低而降低，即表明分辨率随交联剂浓度降低而升高。综上所述，作者认为NIFS水凝胶可以各向同性地扩展嵌入的细胞样品，并且降低交联剂浓度可以提高水凝胶膨胀能力。当优化交联剂EBIS浓度为0.06%，水凝胶的最大膨胀系数可达8.7倍。
图不同交联剂浓度对NIFS水凝胶膨胀性能的影响
接着，作者研究了优化后的NIFS水凝胶作为ExM的性能，并以微管蛋白为例说明细胞结构变化(图3)。作者对膨胀前、后的微管结构进行线剖面分析发现，经NIFS水凝胶膨胀放大后，可观察到精确的微管结构（图3B-E），且该放大过程几乎不会引起微管畸变。同时，作者测量了膨胀前、后微管的半峰宽（FWHM），发现其由膨胀前的79.±4.7nm降低至54.0±10.3nm，显著提高了常规显微镜的分辨率。此外，作者利用NIFS水凝胶ExM进一步细化了在常规显微镜下几乎不可见的细胞核结构（图3L-N），发现利用NIFS水凝胶进行细胞分析能够增强其原始结构的轮廓和图像。
图3优化NIFS水凝胶用于细胞超微结构成像
最后，作者利用NIFS水凝胶ExM技术在常规显微镜下观察之前难以被观察到的超微结构，如核孔复合体（NPC）、网格蛋白涂层凹坑。经过水凝胶膨胀放大后，NPC（Nup）的中空圆孔结构可被清晰地观察到，其三维结构的尺寸与理论接近（图4）。由于长时间曝光对荧光淬灭提出特殊挑战，因此作者开发了一种抗荧光衰减介质，可在80分钟的ExM成像过程中，可保持90%的荧光信号抗光漂白，且分辨率不降低。
图4NIFS用于核孔复合体成像
总结与讨论在该项研究中，作者利用了具有高度吸水能力的、九倍膨胀水凝胶可在自制的集成芯片上放大生物样品，能够在常规显微镜下实现近30nm分辨率的超微成像，可观察核孔复合体等精细结构。自制的简易芯片集成了ExM的所有关键步骤，如细胞培养、固定、染色、锚定、凝胶化等，可简化操作，提高膨胀再现性。此外，在80分钟的成像过程中，抗荧光衰减介质的使用能够在不降低分辨率的情况下减少90%的光漂白。在原则上，NIFS水凝胶可与其他超分辨荧光显微镜技术兼容，能够进一步地将分辨率提高至几个纳米。NIFS水凝胶和超分辨率显微镜的结合可能允许在光学显微镜中获取更好的精细结构和生物分子分布，而不仅仅使用昂贵和复杂的电子显微镜观察。
参考文献1.HongxiaLietal.,Expansionmicroscopywithninefoldswelling(NIFS)hydrogelpermitscellularultrastructureimagingonconventionalmicroscope.Sci.Adv.8,eabm(0)作者：yr审核：sjzpf排版：ych预览时标签不可点收录于合集#个上一篇下一篇转载请注明地址:http://www.abmjc.com/zcmbzz/339.html
