果蔬中过氧化物酶活性的测定

一、目的要求

了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定果蔬组织中过氧化物酶活性的方法。

二、基本原理

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，POD活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，果蔬组织中POD酶活性都会做出相应得应答反应。

过氧化物酶催化过氧化氢（H2O2）氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在nm处有最大光吸收，故可通比色法测定过氧化物酶的活性。

三、材料、仪器及试剂

（一）材料

各种水果和蔬菜。

（二）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶（mL，0mL）。

（三）试剂

1．mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液

母液A（mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至0mL。

母液B（mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至0mL。

取68mL母液A和mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至0mL。

2．50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液

3．提取缓冲液（含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-）

称取mgPEG（聚乙二醇）、4gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1mLTritonX-，用mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至mL。

4．25mmol/L愈创木酚溶液

取μL愈创木酚，用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液稀释至mL。

5．0.5mol/LH2O2

取1.42mL30%H2O2溶液（30%H2O2的摩尔浓度约为17.6mol/L），用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。

四、实验步骤

（一）酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、10×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

（二）活性测定

取一支试管，加入3.0mL25mmol/L愈创木酚溶液和0.5mL酶提取液，再加入μL0.5mol/LH2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

五、实验结果与计算

1．将测定的数据填入下表

2．计算结果

记录反应体系在nm处的吸光度值，制作OD值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD。然后，以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位（U），则U=△OD·min-1·g-1FW。计算公式：

式中：

△OD——反应混合液的吸光度变化值；

△t——酶促反应时间，min；

V——样品提取液总体积，mL；

Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；

W——样品重量，g。

过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长nm处吸光度值读数变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U=△OD·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即：

其中，C表示酶提取液中蛋白质含量（mg/mL）。这里所计算的实际上是酶的比活力，有利于减少操作过程带来的误差。

六、注意事项

1．应进行预实验。测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值（OD0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值的变化量。

2．利用mmol/L、pH6.0磷酸缓冲液作为提取液，可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。配制方法：

母液A：0.2mol/LNa2HPO4溶液（53.65gNa2HPO4?7H2O或71.64gNa2HPO4?12H2O配成0mL）。

母液B：0.2mol/LNaH2PO4溶液（27.6gNaH2PO4?H2O或31.2gNaH2PO4?2H2O配成0mL）。

分别取12.3mL母液A与87.7mL母液B充分混匀，调节pH值，稀释至mL。样品提取液中的其它成分根据需要加入。

3．在提取缓冲液中加入PEG，PVPP和TritonX-等是为了提高酶蛋白的溶解性，减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本书第一篇相关内容。