果胶酶（Pectinase）是一类复合酶，是指分解果胶物质的多种酶的总称，主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、果胶甲酯酶（Pectinmethylesterase，PME）和果胶裂解酶（Pectinlyase，PL）等。其中，多聚半乳糖醛酸酶（PG）通过水解作用和反式消去作用，能切断果胶分子中的α-1,4糖苷键，将果胶分子降解为小分子物质。PG每切断一个α-1,4糖苷键，就会形成一个还原性醛基。通过测定这些还原性醛基生成的量，或果胶分子降解时引起的粘度下降来测定PG的活性大小。
测定果胶酶活性的方法主要有分比色法、滴定法和粘度降低法等。分光光度法测定的灵敏度、准确度均高，重现性好，试剂用量少，尤其是操作省时、简便；滴定法测试重现行好，准确度高，但测定时间长，过程较繁琐，试剂用量较大；粘度降低法测定果胶酶的复合酶活性比较准确，但测定灵敏度不高。在具体测定是，应根据实际需要选择合适的方法。
I．比色法
一、目的要求
学习比色法测定果蔬组织中多聚半乳糖醛酸酶活性的原理和方法。
二、基本原理
果胶在多聚半乳糖醛酸酶（PG）作用下，能水解产生带有还原性醛基的半乳糖醛酸。,5-二硝基水杨酸试剂可与其发生显色反应。根据颜色的深浅程度，可以通过分光光度计测定PG活性的大小。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
柑橘、苹果、香蕉、桃等。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、分光光度计、具塞刻度试管（25mL）、水浴锅、容量瓶。
（三）试剂
1．50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液
母液A（0.2mol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至mL。
母液B（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、稀释至mL。
取6.8mL母液A和4.2mL母液B混合后，调节pH至5.5，稀释至mL，即为50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液。
2．提取缓冲液（含1.8mol/LNaCl）
称取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液溶解、稀释至mL，摇匀。
．1%多聚半乳糖醛酸溶液
称取1.0g多聚半乳糖醛酸，溶于mL50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液中。
4．,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
（1）配制mL含有g酒石酸钾钠的热水溶液；
（2）配制mL的2mol/LNaOH溶液；
（）称取6.g的,5-二硝基水杨酸；
（4）称取5.0g结晶酚；
（5）称取5.0g亚硫酸钠；
（6）将（2）、（）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，搅拌，使之溶解。待冷却后，转入到mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。5．预冷的95%乙醇、80%乙醇
6．1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，转移到mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
四、实验步骤
（一）制作标准曲线
配制一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，按照,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量的方法，用“0”号管作为参比调零，在nm处测定吸光度值，制作标准曲线。
（二）酶液制备
称取10.0g果蔬样品，置于经预冷的研钵中，加入20mL经预冷的95%乙醇，在冰浴条件下研磨匀浆后，全部转入到离心管中，低温放置10min，然后于4℃、10×g离心20min。倾去上清液，向沉淀物中再加入10mL经预冷的80%乙醇，振荡，低温放置10min，然后在相同条件下离心。再取倾去上清液，向沉淀物中再加入5mL经预冷的提取缓冲液，于4℃放置提取20min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，4℃保存备用。
（三）活性测定
取2支试管，每支试管中都分别加入1.0mL50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液和0.5mL1%多聚半乳糖醛酸溶液。再往其中一支试管中加入0.5mL酶提取液，另一支试管中加入0.5mL经煮沸5min的酶提取液作为对照，混匀后置于7°C水浴中保温1h。保温后，迅速加入1.5mL,5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min。然后迅速冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL刻度处，混匀。在波长nm处按照与制作标准曲线相同的方法比色，测定各管中溶液的吸光度值。重复三次。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
根据样品反应管和对照管溶液吸光度值的差值，从标准曲线上查得相应葡萄糖毫克数。多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性以每小时每克鲜重（FW）果蔬组织样品在7°C催化多聚半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的微克数表示，即μg·h-1·g-1FW。计算公式：
式中：
C——从标准曲线查得的葡萄糖量，mg；
V——样品提取液总体积，mL；
Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；
t——酶促反应时间，h；
W——样品重量，g；
1.08——葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数（=/）。
也可以每小时在7°C催化多聚半乳糖醛酸水解生成1μg半乳糖醛酸所需的酶量表示PG活性，即μg·h-1·mg-1蛋白质。酶提取液的蛋白含量可用考马斯亮蓝染色法测得。
六、注意事项
1．在酶液制备过程中，为了将样品中的蛋白质沉淀出来，还可用冷的丙酮进行蛋白质的沉淀操作。
2．酶促反应时间、温度条件必须严格控制，否则会产生较大误差。为减小误差，应特别注意以下两步操作：①果胶溶液先在7℃恒温水浴中预热5min。酶液在7℃恒温水浴中预热2min后，加入预热过的果胶溶液，迅速混合、记时。这样可使反应一开始就在预定条件下进行。②在酶促反应结束时，应迅速操作。
．因为在配制,5-二硝基水杨酸（DNS）时，加入了氢氧化钠，而使得DNS试剂的碱性非常强，强碱抑制了果胶酶的活性。可以利用加入的DNS试剂来终止保温后的酶促反应。
4．一般可以用葡萄糖作为还原糖进行计算各种还原性醛基的生成量，也可以在具体测定某种还原性醛基时，可以用相应的产物入半乳糖醛酸来制作标准曲线。
5．对于某些果蔬样品，以50mmol/L、pH4.5醋酸钠缓冲液作为反应缓冲液，测定效果会更好些。
II．碘液滴定法
一、目的要求
学习碘液滴定法测定果蔬组织中果胶酶活性的原理和方法。
二、基本原理
果胶酶彻底水解果胶生成的半乳糖醛酸，在碱性溶液中可与碘（过量）发生反应。反应后剩余碘的量可通过硫代硫酸钠溶液滴定进行测定，进而计算出酶解反应中产生的半乳糖醛酸的量，用来衡量果胶酶活性的大小。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
柑橘、苹果、山楂、梨等。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、水浴锅、滴定管，三角瓶。
（三）试剂
1．mmol/L、pH4.5醋酸缓冲液（含0.2mol/LNaCl）。
2．1%果胶（多聚半乳糖醛酸）溶液
称取1.0g果胶，加热水溶解，煮沸。冷却后过滤，调节pH至.5，定容到mL。
．1mol/L碳酸钠溶液
4．0.1mol/L碘-碘化钾溶液
称取25g碘化钾，溶于mL水中，再迅速称取12.7g结晶碘，置于烧杯中，将溶解的碘化钾溶液倒入其中，用玻璃棒搅拌直至碘完全溶解后，转入mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，贮于磨口试剂瓶。
5．1mol/L硫酸溶液
取1mL浓硫酸，稀释到18mL。
6．50mmol/L硫代硫酸钠
称取1.0gNa2S2O?5H2O和0.2g碳酸钠，溶于煮沸的蒸馏水，冷却后稀释至mL。
7．0.5%淀粉指示剂
称取0.5g可溶性淀粉，加少量蒸馏水搅匀，调成糊状，随后一面搅拌一面加入约60mL热水，再将此溶液煮沸2~min，静置冷却后定容至mL（可冷藏备用）。
四、实验步骤
（一）酶液提取
同比色法。
（二）酶活性测定
取6.0mL1%果胶溶液，加入1.0mL酶液，在50℃水浴中保温2h后取出，加热煮沸min。待冷却后，取5.0mL反应液移入三角瓶中，加入1.0mL1mol/L碳酸钠溶液和5.0mL0.1mol/L碘-碘化钾溶液，摇匀，加塞，于室温下避光放置20min。然后，加入2.0mL1mol/L硫酸溶液，立即用50mmol/L硫代硫酸钠溶液滴定至淡黄色后，加入1.0mL0.5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠毫升数（A）。
空白试验中，取6.0mL1%果胶溶液，加入1.0mL酶液后立即加热煮沸min。待冷却后，直接从中取5.0mL混合液移入三角瓶中，进行相同操作，然后滴定，记录消耗的硫代硫酸钠毫升数（B）。
五、实验结果与计算
1．将测定的数据填入下表
2．计算结果
在上述条件下，将每克果蔬组织每小时催化果胶分解生成1μmol游离半乳糖醛酸时定为一个果胶酶活性单位（U），则U=μmol·h-1·g-1FW。计算公式：
式中：
C——硫代硫酸钠的摩尔浓度，mol/L；
B——空白滴定消耗硫代硫酸钠体积，mL；
A——样品滴定消耗硫代硫酸钠体积，mL；
0.51——1mol硫代硫酸钠相当于0.51mol游离半乳糖醛酸；
V——果胶酶提取液总体积，mL；
VS——吸取样液体积，mL；
t——酶促反应时间，h；
W——样品重量，g。
六、注意事项
硫代硫酸钠滴定液（50mmol/L）的标定：精确称取0.15g经℃干燥至恒重的基准重铬酸钾，置碘瓶中，加50mL蒸馏水溶解，再加入2.0g碘化钾，轻轻振摇使溶解，最后加入40mL1mol/L硫酸溶液，摇匀，密塞后在暗处放置10分钟。然后加入mL蒸馏水稀释。用本硫代硫酸钠滴溶液滴定至近终点时，加mL淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL的硫代硫酸钠滴定液（50mmol/L）相当于2.mg的重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量，算出本液的浓度即可。在室温25℃以上时，应将反应液及稀释用水降温至约20℃。
III．粘度降低法
一、目的要求
学习粘度降低法测定果蔬组织中果胶酶性的原理和方法。
二、基本原理
果胶溶于水后形成粘稠状溶液。在果胶酶作用下，果胶分子降解，聚合程度和酯化程度降低，果胶溶液粘度降低。因此，果胶溶液粘度的下降程度可以反映果胶酶的活性大小。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
柑橘、苹果、山楂、梨等。
（二）仪器及用具
粘度计、研钵、高速冷冻离心机、计时器、移液器、离心管，水浴锅。
（三）试剂
4%多聚半乳糖醛酸（钠盐）溶液，用50mmol/L、pH4.5醋酸缓冲液配制。
三、操作方法
（一）酶液提取
同比色法。
（二）酶活性测定
反应体系由4mL4%多聚半乳糖醛酸（钠盐）溶液和1mL粗酶提取液组成。分别测定混合液在7℃保温0h和6h时混合液流出粘度计小球的时间。重复三次。
五、实验结果与计算
果胶酶活性以每小时每克鲜重果蔬组织中酶催化多聚半乳糖醛酸水解，所引起的反应混合液粘度下降的百分数表示。
式中：
TI——反应混合液在保温前流出粘度计所需时间，s；
TF——反应混合液在保温后流出粘度计所需时间，s；
t——保温时间，h；
W——样品重量，g。
转载请注明地址:http://www.abmjc.com/zcmbhl/2533.html
