辣椒病毒诱导基因沉默接种方法的优化

病毒诱导的基因沉默（virus-inducedgenesilencing，简称VIGS）是通过携带靶基因的病毒侵染植株从而引起寄主植株对应的目标基因沉默，使该基因不能继续表达，进而探究基因功能的一种方式[1-2]。目前，VIGS技术已被广泛应用，棉花[3]、烟草[4]、拟南芥[5]、大麦[6]、大豆[7]等植物都已经成功构建了VIGS体系，茄科作物[8-10]也开始普遍利用VIGS技术研究基因功能。候选基因VIGS载体构建成功后，农杆菌接种侵染植株是VIGS的关键步骤，农杆菌菌液培养占据了大量的时间，其中菌液的Dnm值是试验的关键点。沉默八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）可使植株出现明显的白化症状，PDS基因常用作VIGS试验的阳性对照基因[11]。本试验以PDS为目标基因构建VIGS载体接种辣椒，分析在农杆菌振荡培养过程中菌液的Dnm值，从而简化摇菌的测量次数，为利用VIGS方法进行候选基因功能验证提供参考。

1材料与方法1.1试验材料供试辣椒材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所高效園艺作物遗传改良重点实验室保存的G43（CapsicumannuumL.）。VIGS载体pTRV1、pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV菌液引自西北农林科技大学。1.2试验方法1.2.1植物材料培养年10月，利用RGL-PD人工气候箱育苗，出苗前30℃、黑暗培养，出苗后，昼、夜温度28、20℃，光照μmol/（m2·s）（光照—黑暗为12h—12h），湿度60%，培养至2张子叶完全展开、真叶尚未长出时用于接种。1.2.2试剂配制试剂的配制参照Velásquez等[12]所述，配制体积稍有改动。20×AB盐配制：NH4Cl20.00g、MgSO4·7H2O6.00g、KCl3.00g、CaCl20.20g、FeSO4·7H2O0.05g，用超纯水定容至1L，℃灭菌20min（若出现沉淀，需要涡旋），备用。

诱导培养基（IM）配制：2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）5.g、葡萄糖2.g、NaH2PO40.g，用超纯水定容至mL，调节pH值为5.6，℃灭菌20min，待溶液冷却后加AB盐26.mL。IM当天或提前1d配制，mLIM使用前加入μLmmol/L乙酰丁香酮、26.mL20×AB盐、μL50mg/mL卡那霉素、利福平、庆大霉素。mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6mg乙酰丁香酮溶于μL二甲基亚砜（DMSO）。乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O1.g，MES1.g，用超纯水定容至mL，调节pH值至5.5，℃灭菌20min。1.3接种方法参照Velásquez等[12-13]的方法。1.3.1划板在-80℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV菌液，冰上溶解，分别在三抗LB琼脂板（含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、50mg/L庆大霉素）上划线，用封口膜封好，标注好名称及日期，置于28℃培养36h左右。

1.3.2挑取单菌落培养准备3个mL锥形瓶，分别加入10mL液体LB培养基（含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、50mg/L庆大霉素），再分别挑取pTRV1、pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS单菌落至锥形瓶中，用封口膜封好，28℃、r/min培养。1.3.3IM摇菌按1∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28℃、r/min培养27～37h至菌液Dnm值达到0.5～0.8。1.3.4收集菌体将菌液分别移入50mL离心管中，4℃、g离心10min，移除液体，加入等体积MES重悬，4℃、g再次离心10min，收集菌体，用1/2体积的MES重悬。向pTRV1内加入mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为mmol/L，按1∶[KG-*3]1将pTRV1分别与pTRV2∶[KG-*3]

00、pTRV2∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮终浓度为mmol/L，Dnm值约为0.6，置于22～25℃静置3～5h，用于注射接种。1.3.5接种幼苗接种前1d浇水。接种时，在子叶中下部靠近叶脉处用2mL一次性注射器打孔，用无针头的一次性注射器在子叶背面注射菌液，直至整张子叶充满水渍。注意在注射不同菌液时要更换手套与注射器，避免交叉污染。1.3.6接种后培养接种后，将幼苗置于人工气候箱中，先18℃、黑暗条件培养2d，再将培养条件调至昼、夜温度22、18℃，光照μmol/（m2·s）（16h—8h），湿度60%条件下培养。接种后3d控水以增加发病率。1.4数据分析试验设5次重复，采用EppendorfBioPhotometerplus测量菌液Dnm值，利用Excel7工作薄进行数据整理分析。2结果与分析2.1不同LB菌液对IM菌液培养时间的影响

对pTRV1、pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS用LB培养基摇菌后Dnm为1.00、1.05、1.10、1.15、1.20的菌液进行IM摇菌，用时20～23h。结果发现，Dnm值在1.15时进行IM摇菌是效率最高的（表1）。当Dnm值为1.00时，用IM摇菌达不到Dnm值为0.5；随着LB培养基Dnm值的增加，用IM摇菌的效率也逐渐增加，到Dnm值为1.15时效率达到最高；当Dnm值为1.20时，用IM摇菌的Dnm值达到0.5的时间开始增加。2.2不同菌体LB摇菌随着时间Dnm值的变化分别对pTRV1、pTRV2∶[KG-*3]00、pTRV2∶[KG-*3]PDS用LB培养基摇菌，并分别在17、18、19、20h测量菌液Dnm值，做3次重复，取平均值，所得结果如图1所示，三者柱状图相似，说明不同菌体之间摇菌时间与对应Dnm值变化相似。因此，若想探究菌体摇菌时间与对应Dnm值变化的关系，仅用1种菌体进行试验即可。

2.3LB液体培养基培养菌液用pTRV1探究菌体摇菌时间与对应Dnm值变化的关系，挑取5个单菌落（A、B、C、D、E），分别用10mL液体LB培养基在mL锥形瓶中28℃、r/min振荡培养，所用时间及对应Dnm值见表2。在摇菌19.0h时菌液C、D、E的Dnm值已达到0.90以上，增加测量密度，19.50h后其Dnm值达到1.00以上，进一步增加测量密度，结果菌液C、D在19.73h、菌液E在19.70h分别达到所需Dnm值，而菌液A、B在摇菌19.00h时Dnm值在0.80左右，可不必增加测量密度。根据测量结果，菌液在摇菌19.70～20.00h后达到所需Dnm值，若想减少测Dnm的次数，可以在摇菌19.00h时测Dnm值，并根据所测值与表2中数据对比，估算再摇菌时间。如Dnm值达到0.90，预计再摇45min可达到所需值；Dnm值达到1.00，预计再摇15min即可达所需值。

2.4IM菌液培养时间与其浓度的关系LB培养基摇菌Dnm值达到1.15左右后，再按菌液∶[KG-*3]IM=1∶[KG-*3]25的比例进行混合，做5次重复，分别为菌液1、2、3、4、5，继续摇菌。由表3可以看出，在相同起始Dnm值下，再进行IM摇菌，所需摇菌时间也有些差异。一般来说，当LB培养基Dnm值达到1.15，再进行IM摇菌，可在摇菌后27h测量，再根据所测数据估计摇菌时间。由于IM摇菌所需时间远远多于LB培养基，而且所需Dnm值范围并不是那么严格，在0.5～0.8均可，初次测量Dnm值时间可以稍微晚一点。由于菌液在不同Dnm值下的增长速度不同，计算不同菌液在不同时间段的平均值可能与菌液的真正Dnm值变化有所差异，因此，菌液原始的Dnm值变化更能说明问题，也更方便做类似试验的研究人员查阅。

2.5MES重悬对菌液浓度的影响2.6pTRV2∶[KG-*3]PDS基因沉默效果從图2可见，接种pTRV2∶[KG-*3]PDS3周后，辣椒幼苗叶片出现白化症状，其中第1、2张叶片的基部及主脉处明显白化，第3张新生叶片全部白化；接种4周后，幼苗第1、2张叶片的白化范围扩大，第3、4张新生叶片全部白化。接种空载体（pTRV2∶[KG-*3]00）幼苗比接种pTRV2∶[KG-*3]PDS幼苗的长势稍好，而未接种植株（WT）明显比接种植株长势旺盛。本试验方法能达到PDS基因沉默的目标，可用于后续的基因功能验证。3结论与讨论随着VIGS技术的逐渐成熟，不同研究人员采用的农杆菌接种方法有所差异，有的用LB培养基摇过之后就直接用MES重悬[9]，此方法虽然也可以使基因沉默，但是用IM再次摇菌可以提高菌体活性，提高沉默效率。

在进行农杆菌接种试验时，LB培养基摇菌的Dnm值将影响后期IM摇菌的Dnm值，本研究得出了最佳的LB培养基摇菌Dnm值为1.15，而且通过所列举IM摇菌数据可以推算所需摇菌时间，从而合理安排开始摇菌时间，因为IM摇菌时间过长会对菌体活性产生影响，尽量避开摇菌结束时间在晚上，以增加菌体活性，保证最高沉默效率。Zhang等的试验中仅说明了在LB液体培养液振荡培养时需要24～36h，IM振荡培养时需20～24h，本试验探究LB培养基和IM摇菌时间与Dnm值的关系，得出LB培养基摇菌要在摇菌17h时测量Dnm值，IM摇菌要在摇菌后27h进行测量的结论[13]。所得时间节点与Zhang等稍微有所差别，但根据本试验结果，在Zhang等的试验条件下LB液体培养基浓度可能比较高，难以掌控菌体最佳活性时期。本试验在Zhang等的基础上更加精确了摇菌时间，方便研究人员参考查阅。采用本研究方法接种，辣椒叶片白化症状明显，说明本试验方案可行，为应用VIGS技术研究辣椒相关基因功能奠定了基础。