文献解读
非酿酒酵母菌对葡萄酒挥发性和感官多样性的贡献：意大利分离的Lachanceathermotolerans、Metschnikowiaspp.和Starmerellabacillaris
期刊：InternationalJournalofFoodMicrobiology（5.）
接收时间：.12
研究背景
“非酿酒酵母菌”一词过去被用来指一组在葡萄发酵过程中对葡萄酒起次要作用的物种，甚至被认为是腐败生物。最近，它们被认为能通过产生独特的代谢物对葡萄酒质量产生有益作用，并且被期望和筛选用作接种剂本身。到目前为止，在葡萄酒生产中接种非酿酒酵母作为共发酵剂是一种很有前景的酿酒实践。但非酿酒酵母菌的发酵性能一般较低，在整个发酵过程中不能占主导地位，但因其代谢影响发酵过程的早期阶段就足以对葡萄酒风味产生重大影响,所以将其作为酿酒酵母菌株的共发酵剂进行接种是当前我们要进行研究的课题。
在过去的几十年里，人们对混合发酵进行了许多研究，针对混合发酵提出了两种不同的方法并进行了测试。共接种包括同时加入非酿酒酵母菌和酿酒酵母菌菌株，二者的浓度可能不同;而顺序接种意味着首先添加非酿酒酵母菌种，然后添加酿酒酵母，因此前一种可以在一定的时间内自行发酵，然后酿酒酵母接管发酵。这两种策略都能够模拟自然发酵过程，以提高葡萄酒的复杂性;然而，大多数研究认为顺序接种是最佳选择。
本研究的目的是探讨检测到的生物多样性，以评价通过连续接种精选的本地非酿酒酵母菌菌株获得的葡萄酒质量。首次对这三个属的几个新分离菌株进行了平行评估，使我们能够对重要的酵母进行直接比较，并看到它们在葡萄酒中的一致性。在本研究中，通过分析接种不同菌株相关的酵母菌种群动力学、主要酿酒参数和挥发性香气化合物，评估了所选定的本地非酿酒酵母菌菌株的贡献程度。最后，进行了基于鼻窦感知的葡萄酒香气分析任务。
材料与方法
1．酵母菌株及生长条件
本研究选取了Lachanceathermotolerans、Metschnikowiaspp.和Starmerellabacillaris，根据它们在基因型和表型特征上的异质性、对葡萄酒胁迫的高抗性以及单次发酵的良好性能来选择。表1显示了选定的本地酵母系的起源和主要的独特酿酒特征。
2.葡萄必须和顺序接种
对新鲜未经处理的试材进行微绒毛处理，然后进行压榨，该过程不接受任何热处理或添加SO2，并在运输至实验室期间保持冷藏，直到接种。三种非酿酒酵母菌株中各选取3个共9个非酿酒酵母菌株与酿酒酵母菌株进行顺序发酵，48小时后接种酿酒酵母EC，在时间0和48小时后接种EC单菌株发酵用作对照。
3.发酵动力学和酵母计数
在整个发酵过程中，每天通过测量由于二氧化碳释放而造成的瓶子重量损失来监测发酵动力学。通过瓦勒斯坦实验室营养琼脂上的平板计数跟踪细胞浓度，添加mg/L氯霉素。在27°C下培养48小时后，可根据非酿酒酵母物种呈现的形态特征对细胞进行差异计数，以区分它们与酿酒酵母。
4.分析决定
当每日失重低于0.05g/L时，通过添加mg/L焦亚硫酸钾停止发酵。在进行化学分析之前，将葡萄酒离心，然后将澄清的上清液装入Y15自动酶分析仪。使用同一制造商的专用酶试剂盒进行光学测量。
5.挥发性资料
对挥发性化合物进行了鉴定和定量，并进行了轻微修改。葡萄酒小份首先采用固相萃取法，然后通过气相色谱-质谱进行评估分析，在HPA气相色谱仪和B四极质谱仪中进行。
6.感官分析
在发酵结束后3个月进行感官评估，该程序包括一项分类任务，其中要求专家组成员首先闻每种葡萄酒的气味，然后根据相似的嗅觉特征将葡萄酒分为若干组。共有13名专家(4名女性和9名男性)评估了20种葡萄酒。葡萄酒样品用随机分配的3位编码进行标签，在室温下，杯中覆盖有塑料培养皿，呈现并在ISO品尝杯中提供。
7.统计分析
分析测定的数据采用单因素方差分析进行比较，然后采用事后Tukey的HSD检验。。利用MicrosoftOfficeExcel软件包，计算了每一次混合接种与EC纯培养相比每种挥发性化合物产量的增加或减少的热图。来自排序任务的数据组织在单个相似性二元矩阵中，然后通过所有小组成员的总和计算共现矩阵，并使用ExcelStats软件，通过Ward标准的层次聚类分析获得树状图。
结果与讨论
1．发酵性能
发酵过程（以CO2释放为代表）如图1所示。连续发酵均在14天内完成，各发酵过程之间无显著差异。然而，对照发酵完成得更快（在9天内），图1还显示了EC的发酵动力学也有类似的趋势，并且在最初的2天内，自然发酵没有发生自发发酵。最近几位作者发现了连续发酵时间过程的类似结果。
图2显示了发酵过程中的酵母细胞动力学。接种的非酵母菌在天然葡萄中生长，根据品种和菌株的不同，达到7–7.5logCFU/mL。这一高水平被认为足以促进葡萄酒的感官特征。在整个发酵过程中，以最高系列稀释度播种的计数平板中未观察到接种前葡萄中约5logCFU/mL的固有微生物群，这表明接种的酵母在种群中占主导地位。接种酿酒酵母后，所有接种的非酵母菌菌株迅速下降，尤其是Metschnikowiaspp.在发酵3天后无法检测到的菌株迅速下降。混合发酵过程中非酿酒酵母菌活力的丧失与主要代谢物（尤其是乙醇）浓度的变化有关，也与发酵液中氧化还原电位的降低有关，因为酒精发酵在瓶中产生厌氧条件。
2.化学分析
评估了非酿酒酵母菌代谢和与酿酒酵母相互作用对葡萄酒成分的直接影响，量化了发酵结束时葡萄酒的主要分析成分。化学分析结果汇总在表2中。在时间0和48小时后接种EC的葡萄酒之间没有发现显著差异，这进一步证明了本地酵母没有生长，并且对发酵的最终结果没有影响。
在每次发酵过程中，所生产的所有葡萄酒的残余糖含量都可以忽略不计，这证实了被测酵母完成了发酵过程。与对照组相比，所有混合接种酒中的乙醇浓度都略有降低，并且在由了Lachanceathermotolerans和Starmerellabacillaris菌株所获得的葡萄酒中乙醇浓度最低；在连续发酵过程中，最终甘油含量较高，尤其是Starmerellabacillaris菌株，这与该物种作为的高甘油制造者的长期声誉一致；与单一EC相比，酵母菌菌株的乙醛水平较低，证实了之前观察到的数据。乙醛可与游离SO2结合，阻碍SO2作为防腐剂的有效性。此外，大量乙醛会影响葡萄酒的香气，并且与SO2一样，会对消费者造成一些与健康相关的问题。
YAN消耗量最高，显著高于单一培养的酿酒酵母。先前的研究报告，与单一酿酒酵母相比，与非酿酒酵母混合发酵的YAN消耗量增加。纯培养物中较低的最终YAN水平可能与更高的氮需求或较低的氮释放有关，但在混合培养物中，一个物种的高氮释放可能会被另一个物种的高消耗抵消。
PCA，应用于每次发酵获得的葡萄酒的化学数据（图3），解释了前两个维度数据中78%的变异性。PCA1占变异性的48.69%，PCA2占额外的28.80%。Starmerellabacillaris菌株生产的葡萄酒化学成分差异最大。事实上，它们位于PCA图的左下象限，其他非酵母菌菌株位于的右象限，其中Metschnikowiaspp.菌株更接近对照单次接种EC，而Lachanceathermotolerans分布在右象限，突出了不同菌株在乙醇、总亚硫酸盐和乙醛还原方面的一些差异。利用非酿酒酵母菌对葡萄酒进行了清晰的分离。此外，在0或48小时接种的单个EC发酵非常接近，证实了重复的一致性以及混合接种对最终结果的主要影响。
3.挥发性轮廓
通过GC-MS对葡萄酒样品进行评估，可以检测和定量32种挥发性芳香化合物，它们属于以下六个化学家族：醇类、羰基化合物、脂肪酸、酯类、挥发性酚类和萜烯类。表S.1列出了这些化合物，并强调了至少一项试验中超过个别气味阈值(OT)的12种化合物。下面主要讨论菌株之间存在显著差异且浓度高于其特定OT的分子。尽管如此，值得注意的是，即使是某些化合物浓度的微小差异，也可能会改变感官评价中对葡萄酒的感知和偏好。
在Metschnikowiaspp.的发酵过程中，属于不同家族的化合物的总和通常较高。比其他非酿酒酵母菌和单一酵母菌要高的多，尤其是浓度高于OT的酯混合培养物显示出的羰基化合物和挥发性酚比对照在接种Lachanceathermotolerans48小时后，顺序接种酿酒酵母可降低所有酯和高级醇的浓度。
在经过连续发酵的葡萄酒中，产生怡人果香和花香的酯类含量高于对照组。最丰富的酯类为辛酸乙酯和乙酸异戊酯。在混合发酵过程中，OT以上的酯（有助于水果感官特性）显著较高。事实上，Metschnikowiaspp.菌株生产的葡萄酒中脂肪酸浓度越高，相应的乙酯含量也越高。
为了更好地观察不同属的非酿酒酵母菌菌株对葡萄酒挥发性成分的影响，图4的热图显示了与对照EC相比，连续发酵中每种挥发性化合物的产量增加或减少。单独考虑芳香化合物，与S.杆菌和L.耐热菌菌株相比，Metschnikowiaspp.菌株的混合发酵显示浓度增加的化合物数量更多，这可能导致总体复杂性增加。然而，在同一物种的品系之间可以看到相关的差异。
通过应用主成分分析法（PCA）对所有31种存在数量显著不同的芳香化合物进行分析，以更好地显示使用所测试酵母菌株获得的葡萄酒的特定特征（图5）。图中表示的第一和第二组分占总变化的43.5%。葡萄酒根据其不同的香气成分进行分离，EC对照品放在右下象限的PCA图上，远离顺序发酵；Metschnikowiaspp.位于右上象限，主要由脂肪酸和相应的乙酯组成；而了Lachanceathermotolerans和Starmerellabacillaris的顺序发酵在它们之间更为接近，并且主要位于左上象限。通过PCA获得的数据表明，使用非酿酒酵母菌对葡萄酒的香气特征有很大的影响，并证实了共发酵剂对葡萄酒性质的相关影响，如上基于酿酒学参数的PCA分析所示。
4.感官评价
使用基于葡萄酒香气的正鼻感知的分类任务，图6显示了通过不同接种策略发酵的葡萄酒之间的相似。将样品分为三组，既可以观察到顺序接种和酿酒酵母EC单菌株发酵之间的明显分离，又能观察到不太显著的聚集水平，这允许非酿酒酵母菌之间存在一定程度的差异。具体而言就是Starmerellabacillari菌株和Metschnikowiaspp.菌株分离良好，而Lachanceathermotoleran菌株分散在其他两个物种中。我们的结果表明，本研究中测试的非酿酒酵母菌与酿酒酵母EC共发酵，能够赋予葡萄酒特定的气味特征，至少在酵母种类水平上允许不可忽略的区分。虽然很难根据酿酒学参数和量化的挥发性化合物预测芳香感受，但通过顺序发酵和纯酿酒酵母培养获得的葡萄酒的显著差异，与之前的PCA观察到的结果一致。
结论
本研究中获得的数据突出表明，在意大利分离的新型本土非酿酒酵母菌株与酿酒酵母进行顺序发酵时，对葡萄酒的成分和香气有积极影响。即使接种酿酒酵母影响非酿酒酵母菌株的存活，它们对葡萄酒特性的总体贡献也得到了明确承认。特别是Lachanceathermotolerans有助于产生相应数量的乳酸，并可最大程度地降低乙醇；Starmerellabacillaris菌株的存在增加了甘油的含量，并显著降低了乙醛和总SO2；Metschnikowiaspp.促进高级醇和酯的形成，并减少挥发性苯酚。此外，感官评价显示，通过顺序发酵获得的葡萄酒与对照葡萄酒之间存在明显的分离，尽管专家组成员无法清楚区分使用的三种非酿酒酵母菌。
混合酵母培养物的最佳使用仍然是葡萄酒行业面临的主要挑战之一，为了在工业水平上进行开发，必须将最佳菌株提交放大试验中，以更大的规模再现实验室水平上观察到的积极影响。制定适合大规模生产物质的配方和策略在未来几年会受到越来越多的
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