通过化学剥离光刻法形成晶圆级生物活性基板

书籍：《炬丰科技-半导体工艺》

文章：通过化学剥离光刻法形成晶圆级生物活性基板图案

编号：JFKJ-21-

作者：华林科纳

引言

生物活性基质的产生需要适当的界面分子环境控制和充分的生物物种识别，同时最小化非特异性附着。本文介绍了一种直接的方法，该方法利用化学剥离光刻技术来产生用于锚定不同生物探针的稀释的自组装单层基质。该策略包括方便的操作，良好可调的图案特征和尺寸，大面积制造，高分辨率和保真度控制，以及功能化多功能生物阵列的能力。通过界面接触诱导的反应，在Au表面上预先形成的烷硫醇自组装单层破裂，并产生独特的富含缺陷的稀释基质。发现该剥离后区域适于插入各种生物探针，这允许产生不同类型的生物活性基底。根据对实验条件的修改，直接探针插入、分子结构变化所需的识别和大体积生物物种结合的过程都是以最小的非特异性粘附完成的。此外，通过整合微流体还实现了多路复用阵列，这使得所制备的基底能够有多种应用。通过包含良好可调的图案特征尺寸和几何形状、良好的局部分子环境控制和晶片级制造特性的特性，这种化学剥离工艺将传统的生物活性衬底制造推进到更方便的途径。

介绍

微纳米尺度上的图案化在现代科学和工程研究领域中起着关键作用。特别是具有明确几何形状的生物活性表面的产生满足不同应用的特定需求的要求，采用合适的微/纳米制造方法是必要的。光学平版印刷术允许大面积制造的事实为生物活性基质制造提供了一条可行的途径，但是当需要非常精细的控制时，受到光衍射的限制。另一方面，基于扫描束的光刻技术允许高度可控的精细特征尺寸，但是受到大面积图案的低得多的生产速度的限制。因此，在生物活性基底的制造中广泛采用组合和互补的方法，这些方法还提供了方便的工艺、经济的操作、大规模再现和高分辨率控制的优点。

制造生物活性基底的传统策略依赖于创造不同的局部分子环境，这些环境适合于随后的生物物种附着。例如，由于其对细胞膜的模拟特性，支撑的脂质双层系统已经广泛用于许多生物物理研究[5,6]。这些平台通常使用平坦的玻璃表面来支持通过囊泡融合形成脂质双层。随着微流控器件和光刻技术的结合，已经实现了多重阵列的创建，并提供了诸如蛋白质-配体结合研究和生物物种感测的应用[7-9]。另一个被广泛采用的系统是自组装单层(SAM),它操作简单，在环境条件下稳定性高[10,11]。这些方法利用硅烷或硫醇分子在二氧化硅或金表面上的自排列，这已被证明是一种制备多功能目标功能表面的方便途径[12-16]。除了直接表面修饰，锚定分子尾基的多功能性提供了进一步的功能选择，这有利于可变识别阵列的制造[17-20]。应该注意的是，为生物物种识别建立合适的表面环境需要选择合适的分子部分，这不仅是为了更好的配体-靶相互作用，也是为了降低物体的非特异性结合。因此，在生物活性基底制造中，非常需要在大面积表面上进行高度可控的分子操作。

最近开发的化学剥离光刻(CLL)技术是一种为各种应用创建具有不同表面特性的不同区域的直接方法[21]。在共形接触诱导反应中，烷基硫醇SAM覆盖的Au基底上的顶层Au–Au键断裂导致新鲜Au暴露在外部环境中。因此，这些空位可以用不同的分子，例如配体来填补，并且底物对生物反应是有活性的。与常规相比-

这种方法解决了分子横向扩散和气体传输障碍的问题。因此，所制造的特征分辨率可以低至30纳米尺度，具有高的图案保真度[。此外，可归因于来自剥离过程的原子级台阶边缘的所产生的图案的极大稳定性允许所产生的平台的长期使用.值得注意的是，剥离过程产生了非常独特且非常适合生物活性探针插入的局部分子环境。由于接触诱导反应的不完全性，与其他SAM系统相比，剥离后区域表现出不寻常的行为。这里，剥离过程产生了稀释的分子基质环境，这预计是由于在SAMs中部分硫醇Au被去除。通过对实验条件的适当调整，这种“稀释的富含人造缺陷的”基质提供了大量的机会，通过简单的一步SAM缺陷控制来产生不同的生物活性基底。与传统的生物平台相比，这种基质具有以下优势:广泛的探针兼容性、最小化的非特异性生物物种粘附、多功能平台创建、精确控制的生物分子定位和简单的操作。为了研究剥离工艺制造各种生物活性基底的能力，测试了具有不同分子行为和多重阵列结构的探针。所产生的独特表面环境也可用于制作具有不同几何形状、大范围特征尺寸和结构可重复性的图案，这在实际生物活性基底组装中是很重要的。为了进一步将这种方法扩展到生物学上重要的探针锚定的多重模式，还引入了微流体与CLL操作的新整合。此外，这种策略能够通过一步表面缺陷丰富的基质生成直接创建晶圆级生物活性基底，这极大地促进了用于实际用途的生物功能平台制造的创建。

实验

CLL法制备生物活性基质。通过热蒸发制备具有纳米厚的Au和5纳米厚的铬粘合层的硅衬底(台湾新竹的Mustec公司)。将Au基底浸入0.5mMMCU或TEG乙醇溶液中超过6小时以形成自组装单层。SAM形成后，用乙醇洗涤基底以除去过量的硫醇分子，并用氮气吹干。具有各种图案的聚二甲基硅氧烷(PDMS)印模由标准的光刻制造的母版制造。将质量比为10∶1的SYLGARD硅氧烷弹性体基料和固化剂(DowCorning，Midland，MI，USA)充分混合，在真空下脱气，浇铸到母模上，并在℃下在铝热板上固化过夜。将PDMS印模从母模上分离，依次用丙酮和异丙醇冲洗，然后用氮气吹干。

多路生物探针锚定平台。在40秒的氧等离子体处理后，将平坦的PDMS印模保形地密封在MCUSAM修饰的Au基底上60分钟。在印模移除后，将Au基底共形密封到另一个等离子体处理的印模上，形成20个微米微通道。将三种不同的硫醇化探针溶液(在25mMTRIS缓冲液中的5微米，mMNaCl，1微米TCEP，pH8.2)引入到分开的通道中，用于60分钟的生物分子插入。然后在去离子水浴中将微通道印模从Au基底上快速分离。最后，在进一步使用之前，用去离子水和25mMTRIS缓冲液(pH7.4)轻轻冲洗金表面。

结果和讨论

使用CLL制造生物活性基底取决于几个控制因素，以产生用于生物分子识别的合适的表面环境。亲水基团封端的烷硫醇分子对氧等离子体处理的PDMS表面提供了强相互作用是通过衬底顶层Au–Au键断裂产生SAM破裂的最佳选择。CLL操作的另一个重要任务是选择合适的分子基质，其中分子水平的空间效应的影响支配着生物探针的插入或相应配偶体的识别。基于十一碳链的11-巯基十一醇(MCU)分子由于其在Au上良好的自组装行为和适合于接触反应的对活性PDMS表面的羟基尾基，因此在本研究中被选择。标准CLL操作的示意图如包括PDMS活化、接触诱导反应、剥离步骤和生物分子锚定。应当注意，保形接触反应不需要外部压力，并且剥离操作是在环境条件下进行的。如的AFM图像所示Figure1当使用具有凸出正方形图案的PDMS印模时，SAM-修饰的Au表面在CLL操作后显示出凹陷的正方形图案。这个凹陷区域代表一个新暴露的金区域，它为随后的生物探针插入提供了位置。为了可视化，使用了更长分子长度的硫醇化分子，并给出了反向突出的形貌图像，描绘了成功的探针插入。

在这种方法中，填充在新产生的Au区域内的生物物种应该保持其对目标的活性，以用于有前景的实际应用。为了便于研究，应用了基于荧光信号读出的方法，并通过显微图像进行描述。研究了三种不同类别的生物探针及其结合配偶体识别能力，包括直接信号报告标记探针插入、结合配偶体识别触发的探针结构改变以及插入探针的三明治样信号报告。在最直接的探针直接插入方法中选择具有羧基荧光素(FAM)部分标记的尾部的基于巯基化六碳链的核苷酸探针用于证明.该探针在表面上的锚定呈现高荧光图像对比度，这表明在平板上有足够的空间和适当的分子取向形式。这一观察结果归因于不完全的接触诱导反应，导致在剥离后区域中残留烷硫醇分子，允许插入的分子自我定向并减少非特异性探针-底物粘附。第二种类型的生物活性基质制造方法依赖于标记探针附着，随后结合配偶体识别诱导信号输出。首先将FAM标记的巯基化发夹结构的核苷酸探针插入剥离后区域，然后引入其互补的核苷酸配偶体。在引入结合配偶体之前，荧光信号被染料与Au的近距离猝灭，随后观察到的高对比度荧光图像表明在结合配偶体识别步骤中需要足够的表面空间。该结果证实了由剥离后区域支撑的稀释的分子基质提供了无空间位阻的环境。

这有利于将其他分子识别到基底上。第三种类型的人造生物活性基质依赖于活性配体的锚定，该活性配体可以识别溶液中相应的蛋白质配偶体(图2C).为了最大限度地减少蛋白质的非特异性吸附，选择含有低聚(乙二醇)部分的TEG分子作为基质材料，其也可以在CLL操作中通过活化的PDMS印记除去[21]。在配体-蛋白质结合过程之后，通过一级抗体和报告标记的二级抗体的顺序附着，使用类似三明治的分析。与前两种底物类型相比，这种庞大的分析设计需要空间环境来提供有效的识别。很明显，通过这种方法产生的荧光图案也呈现出非常高的对比度，表明即使对于庞大的生物物种，剥离后区域也提供了合适的环境。从三种生物活性基质类型在适当的实验条件调整下对不同分子和识别过程的巨大能力，证实了CLL处理的表面在各种应用中的巨大潜力。

应该注意的是，分子基质组成在生物物种选择性识别中起着关键作用[14,15,33,34]。因此，当采用不同的生物捕获环境时，预期会有不同的探针密度要求。利用简单的CLL操作和烷硫醇SAM形成的便利性，界面接触诱导的反应可以用于满足适当的探针量控制。如所示不同百分比的羟基封端的MCU和甲基封端的UT分子被用于在Au上形成自组装膜。此后，通过CLL工艺处理衬底并在相同条件下与FAM标记的核苷酸探针一起孵育。可以清楚地看到，探针锚定区域的荧光强度随着MCU百分比的增加而降低，这可以归因于两个可能的因素。首先，缺少对甲基封端的链烷硫醇的活化PDMS表面的接触诱导反应减少了基质中可提升的金硫醇盐的量，导致CLL工艺中SAM缺陷产生的减少。在MCU百分比降低的情况下，对[Ru(NH3)6]3+CV响应降低以及氧化还原峰分离δEp更大(从0.08V到0.15V)的一致观察也表明SAM环境中的缺陷更少第二，由于甲基封端的链烷硫醇的存在，疏水性增加，导致不利的亲水性生物探针插入。因此，观察到的荧光信号随着基质中UT分子比例的增加而减少。重要的是要注意，虽然单链DNA探针可以非特异性地吸附在甲基封端的SAMs上它们对荧光图像对比度的贡献是由于染料-金距离近引起的非辐射能量转移。考虑到可控的基质组成和CLL操作的简易性，表面探针的数量可以很好地调节以满足不同生物平台的各种需要。

CLL创造的独特的分子环境也可以扩展到制作多重生物活性阵列。如所示Figure4通过微流体装置和CLL处理的表面的组合来制造空间寻址的生物探针锚定的衬底。稀释的MCU烷烃-硫醇基质首先通过应用活化的无特征PDMS与整个SAM-修饰的Au表面相互作用来产生，随后是后续的剥离步骤。

因为生物活性表面特征的尺寸和几何形状可能会影响基底实际应用的能力和锚定探针的功能，所以对基于CLL的制造工艺进行了测试，以产生具有不同维度的各种分子排列的表面。如所示Figure5，不同的PDMS邮票呈现出不同的几何形状，或是突出(图5AC、E、G和H)或按下(Figure5BD和F)特征应用于SAM-改性的Au表面，以产生分子矩阵图案。通过采用简单操作的信号报告标记探针插入策略，获得了具有多种几何形状的高对比度荧光图像，并且没有观察到不同尺寸的明显信号输出波动。应该注意的是，通过CLL过程产生的生物活性基底也可以在大面积上非常均匀。如所示Figure6从4英寸硅晶片衬底上的不同采样点获得的荧光图像代表了具有最小信号波动的相同结果。人造生物活性模式的高重复性和放大能力证实了该技术在实际应用中的潜力。

结论

化学剥离工艺能够以简单的方式制造各种生物活性基底。该方法通过活化的PDMS印模和之间的界面接触诱导的反应产生大量的烷硫醇SAM缺陷。