多肽固相合成经常使用的显色剂有哪些

在多肽固相合成中，我们通常使用一些显色试剂对肽树脂进行检测，来保证能够快速定性检测氨基酸是否偶联完全、Fmoc保护基团是否脱除成功。由于具有显色反应迅速，显色明显，检测灵敏度高等优点，茚三酮显为最常用的显色试剂。溴酚蓝，四氯苯醌等也是比较常用的显色试剂，下面看一下各种显色试剂的配制，使用方法以及注意事项。

1.茚三酮显色试剂

可以清楚地显示游离胺的存在，由Kaiser等人开发因此也叫做Kaiser检测。该测试通常在氨基酸偶联过程之前和之后进行，目前应用最广泛的检测试剂。

1.1配制方法

试剂A:80g苯酚溶于20ml乙醇，为方便配制，苯酚可以提前加热融化后配制。

试剂B:2ml的0.M的KCN水溶液加入98ml重蒸后的吡啶中。重蒸吡啶过程中可以加入少量茚三酮以除去吡啶中能使茚三酮变色的物质。

试剂C：5g茚三酮溶于95ml乙醇中。

1.2检测方法

在杜氏玻璃小管中加入少量树脂，一般使用铺满试管底部一层的树脂，之后加入上述配制好的A、B、C三种试剂各两滴，在-℃下加热3-5min。如果树脂显蓝色说明存在未保护的氨基，脱Fmoc完成。如果树脂无色说明偶联反应完全。

1.3使用说明

Kaiser测试虽然是目前应用最广泛的检测方法，但他也有自己的局限性，例如不能检测二级胺（如脯氨酸），也不能检测无α-H的氨基酸的氨基（如二氨基异丁酸，α-甲基亮氨酸等α-双取代氨基酸）。其机理如下图

Kaiser测试原理

茚三酮首先脱水与氨基缩合得到亚胺，随后亚胺脱羧后异构化为另一种形式的亚胺，水解后释放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺进一步与茚三酮发生缩合得到二聚的亚胺衍生物从而显色。

2.四氯苯醌显色试剂

四氯苯醌显色试剂主要用来检测二级胺（如脯氨酸），也是一种比较常用的显色试剂。由于脱Fmoc试剂一般都是二级胺（如哌啶，吗啉，二甲胺），因此也可以用四氯苯醌显色试剂来检测肽树脂从而判断使用二级胺脱Fmoc后残留的二级胺是否被洗涤干净。

2.1配制方法

试剂A:2g四氯苯醌溶于98mlDMF中

试剂B:2ml乙醛溶于98mlDMF中

2.2检测方法

在杜氏玻璃小管中加入少量树脂，一般使用铺满试管底部一层的树脂，之后加入上述配制好的A、B两种试剂各两滴，室温下放置5-10min，若存在未保护的氨基一般树脂显蓝绿色。

3.溴酚蓝显色试剂

显色快速而敏感，但由于显色过于敏感，偶联结束后显色常常显示伪阳性。

3.1配制方法

1g溴酚蓝溶于99mlDMA中。

3.2检测方法

在杜氏玻璃小管中加入少量树脂，一般使用铺满试管底部一层的树脂，之后加入上述配制好的溴酚蓝溶液，立即显色。如果树脂显蓝色说明存在未保护的氨基。

4.TNBS显色试剂

TNBS显色试剂

4.1配制方法

试剂A:5mlDIPEA溶于95mlDMF中

试剂B:1gTNBS溶于99ml水中

4.2检测方法

在杜氏玻璃小管中加入少量树脂，一般使用铺满试管底部一层的树脂，之后加入上述配制好的A、B两种试剂各两滴，室温下放置10min，如果树脂显黄色或红色说明存在未保护的氨基。