一、目的要求
了解同工酶的作用及意义，学习利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离果蔬组织中可溶性蛋白质和进行同功酶检测的方法。
二、基本原理
同工酶（Isoenzyme）是指能催化同一种化学反应，但其分子结构不同的一组酶，它和其他种类的蛋白质一样，都是DNA编码的遗传信息表达的产物。在果蔬的生长发育、成熟衰老的各个阶段，组织中的同工酶并不相同。同工酶的合成还受果蔬组织或器官的形态特征、发育来源和生长环境条件的影响。因此，在研究果蔬基因表达调控以及许多生理遗传问题时，常常要分析可溶性蛋白质和同工酶变化，这在理论和实践中都具有十分重要的意义。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可溶性蛋白质和分析同功酶变化，方法简便，灵敏度高，重现性强，结果便于观察、记录和保存。
根据同工酶能催化同一种化学反应的特点，在样品中可溶性蛋白质经电泳分离之后，再在合适条件下进行专一活性的染色，就可以观察到不同的同工酶谱带。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
苹果、梨、番茄等果实；菠菜、香菜等蔬菜。将材料洗浄去除表面土粒和灰尘待用。
（二）仪器及用具
电泳仪1套（稳压电源、垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）、台式高速离心机、水浴锅、离心管、移液器（5mL、μL、μL、50μL）、烧杯若干（mL、50mL）、容量瓶（mL、mL）、研钵、玻璃棒、滤纸、20mL培养皿2个（或用白瓷盘代替，染色用）、海绵块、摇床、镊子。
（三）试剂
1．30%丙烯酰胺（ACr，未纯化的试剂，配制后需过滤）
2．1%甲叉双丙烯酰胺（BIs）
3．10%的过硫酸铵（AP，冰箱贮藏，不得超过5天）
4．分离胶缓冲贮备液（3mol/LTris-Hcl，pH8.8）：称取36.6gTris溶于30mL蒸馏水和48mL1mol/LHCl中，调节pH至8.8，定容至mL。
5．浓缩胶缓冲贮备液（0.5mol/LTrIs-HCl，pH6.8）：称取6.0gTris溶于40mL蒸馏水和48mL1mol/LHCl，调节pH至6.8，定容至mL。
6．电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，pH8.3）：称取3gTris、14.4g甘氨酸，溶于重蒸馏水并定容至mL，使用时稀释10倍。
7．N,N,N′,N′－四甲基乙二胺（TEMED）
8．提样缓冲液：稀释4倍的浓缩胶缓冲液。
9．样品处理液：分别取10mL50%甘油，0.5mL0.1%溴酚蓝，5mL1mol/LpH6.8Tris-HCl溶液，9.5mL蒸馏水，混合。
四、实验步骤
（一）凝胶制备
1．取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用热去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择1~3mm厚的玻璃或Teflon夹条，安装并用胶条将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制1.5%琼脂液（冬天1.5%，夏天2%），沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔，再直接于琼脂盒将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连续琼脂封闭区。
2．根据需要从表26中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同功酶可选择7.5%~10%的胶（过氧化物酶和酯酶7.5%较合适，超氧化物歧化酶用10%，可溶性蛋白可根据需要配制）。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10min，加入15μLTEMED；混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程要防止气泡产生。胶液加到离凹槽3cm处为止，立即用移液器轻轻在胶溶液上面铺1cm高的水层，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶和水层之间出现清晰的界面时，表示聚合已完成。用移液器小心吸出上层覆盖水，按表26配制好浓缩胶，抽气后加入5μLTEMED，混合后加到分离胶上层，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。
（二）样品制备
称取2.0~5.0g果蔬样品组织，加入5mL提样缓冲液，研磨匀浆后于4℃×g离心20min，收集上清液即为酶粗提液。取0.5mL酶提取液，与等体积样品处理液混合后贮于4℃备用。
（三）操作步骤
1．上样
将制好的凝胶板夹在电泳槽上，向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（注意不要拉断样槽隔墙）。将移液器针头插入样槽下部慢慢进样，每槽点样15~20μL。
2．电泳
上槽接负极，下槽接正极，接通电源，电流调至15~20mA，电压为V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止，将电流、电压调至零后断电。
电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。
3.染色
（1）过氧化物酶同工酶染色
称取0.1g联苯胺，加入少量无水乙醇溶解，再依次加入10mL5mol/L乙酸，10mL1.5mol/L萘乙酸，70mL蒸馏水，最后加入3~5滴H2O2，混合后即为过氧化物酶同工酶染色液。将此染色液倒入直径20cm的玻璃培养皿中，放入电泳凝胶片后置于摇床上不断振荡。观察各条带显色的程度。最后用7%醋酸溶液固定（注意色带在醋酸溶液中容易退色，固定时间不宜过长），拍照或制成干胶片保存结果。
（2）酯酶同工酶显色
分别称取50mgα-醋酸萘酯，50mgβ-醋酸萘酯，mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），加入到小烧杯中，用约5mL丙酮溶解后，再用0.1mol/LpH5.0的磷酸缓冲液稀释到mL即为酯酶同工酶显色液。将胶片浸入此显色液中，在室温下保持约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带，弃去染色液，用蒸馏水漂洗，再用7%醋酸溶液固定，照相或扫描保存。
（3）超氧化物歧化酶同工酶染色
分别配制25μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液，0.01%核黄素溶液和50mmol/LpH7.8磷酸缓冲液（含1mmol/LEDTA）。染色时，先将电泳胶片放入到盛有80mLNBT溶液（根据胶板大小加减溶液用量）的培养皿中，浸泡15min后，将胶片取出，再置于核黄素溶液浸泡5min。然后，将胶片再放入到磷酸缓冲液中，在距胶片10cm的高度，用40W日光灯直射胶面，直至胶片蓝色背景上出现透明条带为止。
（4）过氧化氢酶同工酶染色
染色液的组成：A液由25mL3%H2O2，5mL0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液，5mL0.1mol/LNa2S2O3组成；B液由25mLmmol/L碘化钾和25mL蒸馏水混合配制而成。先将电泳胶片浸泡在A液中，室温下放置15min，然后倒去A液，用蒸馏水彻底冲洗干净后，加入B液。酶活性表现在蓝色背景上的白色区带。蒸馏水漂洗后用10%甘油固定。
（5）可溶性蛋白质的染色
称取0.2g考马斯亮蓝R，用少量无水乙醇溶解后，用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀释至mL，即为染色液。取mL乙醇，70mL冰醋酸混合后，加蒸馏水稀释至mL，即为脱色液。
将胶片浸入染色液中，在室温下染色5~6h后，倒去染色液，用水冲洗附着于胶面的染料。然后将胶片浸入到脱色液中进行脱色，多次更换脱色液，直到胶片背景清晰为止。
4．结果保存
将脱过色的凝胶照像或扫描后作为实验报告的凭证。作为学生实验报告可用绘图或制作干胶的方法记录酶谱带或可溶性蛋白质的主要谱带或用干胶片保存结果。
绘图表示：将各酶带按颜色深浅绘成谱带图。
记录实验的操作程序，检查是否和原设计相符合。将各胶柱中酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入下表中。比较组分胶柱中、着色最深的酶带或特殊酶带（即该组分特有酶带），计算酶带的相对迁移率Rf值
五、注意事项
1．注胶液前应检查准备好的玻板是否有漏。
2．加满胶液的玻板应尽量放置静置，以使凝结后的胶面平整并与玻璃板壁垂直。
3．溴酚蓝为小分子物质，在电泳过程中跑在同工酶蛋白的前头，故凝胶柱中溴酚蓝带与点样一端之间的区段上的色带，为同工酶谱。
4．最好将电泳时温度控制在4℃左右，以避免酶的活性下降。
5．SOD同工酶电泳时，分离胶浓度应选择10%，样品提取液用50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液比较理想。
转载请注明地址:http://www.abmjc.com/zcmbyf/2550.html
