线粒体异柠檬酸脱氢酶ICDHm活性检

线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA

产品规格：管/96样

产品简介：

线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。

异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；

2.试剂一：临用前加入5mL试剂三，充分溶解待用；

3.试剂二：临用前加入5mL试剂三，充分溶解待用；

4.试剂四：临用前加入0.mL双蒸水，充分溶解待用；

5.标准品：10mgα-酮戊二酸。临用前加入μL蒸馏水，配成μmol/mL标准液；

6.工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按1:1比例混合，现配现用。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1.称取约0.2g组织或收集0万细胞，加入1mL提取液一和10μL提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2.4℃，0g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，10g离心15min。

3.上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4.在沉淀中加入μL提取液三和4μL提取液二，超声波破碎（功率40%，超声5秒，间隔9秒，4min），4℃，00g离心10min，取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1.可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至nm，蒸馏水调零。

2.将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.、0.0、0.μmol/mL标准溶液。

3.操作表（在0.6mLEP管/96孔板中进行如下操作）：

三、ICDHm活性计算

1.标准曲线绘制

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。

2.酶活力计算

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmolα-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm酶活力（U/mgprot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×=x÷Cpr×16.67

V上清：加入上清液体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V反总：反应体系总体积，0.2mL；T：反应时间，1h=60min；：单位换算系数，1μmol=nmol。

注意事项：

1.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2.推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

3.附：使用样本重量计算公式

A、上清（胞浆）中ICDHm活力计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmolα-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×=16.83×x÷W

V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样：加入上清液体积，0.04mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；：单位换算系数，1μmol=nmol。

B、沉淀（线粒体）中ICDHm活力计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmolα-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×=6.73×x÷W

V提取：沉淀重悬时加入提取液体积，0.mL；V样：加入上清液体积，0.04mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；：单位换算系数，1μmol=nmol。

C、样本ICDHm总活力计算：

样本ICDHm总活力即为上清（胞浆）中ICDHm活力与沉淀（线粒体）中ICDHm活力之和。

按样本质量计算：ICDHm（U/g质量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W