Title:Syntheticdynamichydrogelspromotedegradation-independentinvitroorganogenesis
Authors:AntoniusChrisnandy,DelphineBlondel,SabaRezakhani,NicolasBroguiereandMatthiasP.Lutolf
NATMATER
DOI:10./s---7
引言
上皮类器官在小鼠肿瘤来源的重组细胞外基质水凝胶中高效生长，其成分定义不清、批次间的变异性和免疫原性限制了临床应用。解决的方法主要集中在由共价交联的亲水性大分子组成的非适应性水凝胶上。然而，在弹性凝胶中，组织膨胀所产生的过大的力严重限制了器官的生长和形态形成。化学或酶降解方案可以部分缓解这一问题，但由于其不可逆性，长期适用性有限。
在这里，洛桑联邦理工学院MatthiasP.Lutolf(通讯作者)团队报道了一系列合成的水凝胶，通过可逆氢键介导的动态重排促进了广泛的器官形态形成。可调节的基质可以缓解压力，从而通过增加对称性破坏和依赖于yes相关蛋白1的Paneth细胞形成来促进肠道干细胞上皮细胞高效的隐窝萌发。因此，这些定义良好的凝胶为培养复杂的体外形态发生提供了有前景的多功能基质。
图1：PEG-胞嘧啶50的合成与设计
(a)通过甲氧基聚乙二醇-苯基乙烯基砜(PEG-VS)的两步修饰合成甲氧基聚乙二醇(mPEG)和8-PEG前体，导致胞嘧啶功能化。(b-c)DLS测量显示，在生理pH下，3wt%mPEG,5kDa和8-PEG,40kDa的粒径分布，用于端基为COOH、苯胺和胞嘧啶的官能化。显示所有大分子单体复杂的尺寸分布，具有较多的聚集颗粒尺寸，这可能是由于多臂PEGs的树枝状结构造成的。(d)从65°C冷却到25°C(以0.5Hz和1%应变测量)时，改性8-PEG前驱体(7%w/v，pH7.4)的复合粘度的演变。表明物理交联剂通过氢键参与了具体和渐进的过程。(e)经修饰的8-PEG-胞嘧啶50(7%w/v，pH7.4)从65°C冷却到25°C，在酰胺I和II(上)和酰胺A(下)区域的FTIR光谱发生了位移。
图2：杂化水凝胶的合成及物化性能
(a)由8-PEG-胞嘧啶50和8-PEG硫醇(8-PEG-TH)组成的末端官能化的8-PEG大分子的共聚反应，导致了两种交联网机制，通过Michael-type加成共价交联和通过胞嘧啶的氢键物理交联。(b)共价水凝胶(Covalent)的凝胶动力学与PEG含量有关。(c)与Hybri50凝胶相比，Covalent凝胶在所有浓度的PEG凝胶中表现出更高的硬度，这可以归因于共价键的更高强度。(d)水凝胶在37℃的细胞培养介质中7天的稳定性。Hybri50水凝胶表现出与Covalent凝胶类似的稳定性。(e)不同末端官能化溶胀(在24h，生理pH，5%CO2和37℃条件下)合成水凝胶和基质胶(Matrigel)(37℃下10%应变)的应力松弛曲线。
图3：杂化水凝胶的类器官再生
(a)在Matrigel中从单个小鼠小肠(MSI)干细胞到形成类器官的示意图。(b)在Matrigel中生长的小鼠ISC菌落(顶部)和萌芽类器官(底部)的代表性图像。(c-f)在第4天和第7天不同硬度(、和Pa)的Covalent和Hybrid50凝胶中小鼠ISC菌落形成的图像及数量。两种基质的菌落形成效率没有显著差异，表明ISC菌落形成可能对动态力学性能不敏感；弹性模量可能是ISC菌落形成的关键参数。虽然在较硬的Hybrid50凝胶(1kPa)中发现相对较低的隐窝形成效率(~15%)，但观察到这些组织由小突起36组成。(g)第7天，在两种不同硬度(和Pa)下，在Matrigel、Covalent和Hybrid50凝胶中扩增单个mISC形成的类器官的多细胞图像。Paneth细胞、肠细胞、干细胞和祖细胞分别用Lyz、Aldob和Sox9标记。免疫荧光分析显示，隐窝中同时存在干/祖细胞(Sox9)，以及Hybrid50凝胶中生成的类器官中的关键分化肠细胞。
图4：小鼠肠道类器官在凝胶中的发育
(a、b)第7天在Matrigel、Hybrid50和Covalent凝胶(和Pa)中的类器官形态群体。其中存在Paneth细胞(Lyz+)和肠囊肿(圆形，Aldob+细胞)。在软Hybrid50凝胶(Pa)中发现类器官的最高频率(budding:46%)。相比之下，约43%和约80%的类器官分别在软(Pa)和硬(1kPa)Covalent凝胶中形成圆形肠囊肿。(c、d)第4天，单个mISC在不同水凝胶中形成的菌落(Lyz-或无Paneth细胞)的Yap1定位图像及定量分析。与Covalent凝胶相比，在两种硬度下，Hybrid50凝胶中生长的上皮菌落中具有核Yap1的细胞比例显著高于Covalent凝胶。
图5：长期人体类器官培养
(a)通过对酸解酶敏感的多肽进行可诱导降解的设计，以允许器官长期传代。(b-c)在每一代的第6天，在SS-Hybri50水凝胶和Matrigel中培养的五代hSI器官图像与细胞数统计。亮场成像表明，hSI类器官可以在至少五代杂交基质中繁殖。在SS-Hybri50凝胶中，每一代的平均扩增效率是两到三倍。(d)在第5代末期，hSI类器官在Hybri50凝胶和Matrigel中形成的多细胞组织图像。杂化水凝胶中的hSI类器官呈多细胞模式，类似于Matrigel。(e)实时定量聚合酶链式反应(QPCR)数据热图，显示在SS-Hybri50凝胶中培养的单个细胞在六天内的分化细胞标志物。肠细胞标记物，在所有hSI系中都有较高的表达。相反，干细胞标记OLFM4和LGR5下调，解释了SS-Hybri50凝胶与Matrigel相比扩增能力总体较低的原因。
小结
与传统的合成水凝胶相比，本研究的混合型应力松弛凝胶能够适应组织扩张和发育过程中发生的力学变化，而不依赖于不可逆转的网络降解。合成的水凝胶结合了两种不同的交联方案，例如基于共价和疏水共价和疏水、范德瓦尔斯、离子或分子识别相互作用的合成水凝胶已经被报道，被证明在细胞培养应用中很有前途。然而，这种水凝胶还没有被证明支持3D类器官培养。本文强调了先进的器官培养需要减压基质。虽然还需要进一步的研究来确定解释上皮干细胞(如肠道干细胞)如何感知外部物理环境并与其相互作用以实现适当的形态形成的分子机制，但越来越多的证据表明动态机械性能的重要性正在塑造下一代生物材料的设计标准。这种动态凝胶将允许更精确的环境控制，以支持改善类器官的生长和形态。
上述研究成果在《Naturematerials》上在线发表，题为“Syntheticdynamichydrogelspromotedegradation-independentinvitroorganogenesis”。洛桑联邦理工学院AntoniusChrisnandy，为论文第一作者。洛桑联邦理工学院MatthiasP.Lutolf，为论文通讯作者。
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