凝胶渗透色谱柱的填装技术

近年来，随着液相色谱技术的发展，装柱技术也有了新的发展，但目前还没有一个能对所有凝胶填料都适用的装柱方法，技术人员需要根据各种凝胶的性质和粒度大小来选择合适的装柱方法。但不管怎么样，装柱总有一个基本原则，装柱应尽可能使凝胶柱装填均匀和紧密，柱中没有空隙裂缝或沟漕，也不产生柱的径向或轴向凝胶的粒度的不均匀分布，以减少涡流扩散等导致的峰加宽效应。

目前，色谱柱的装填技术主要有三种方法：干法装柱、湿法装柱和等密度均浆装柱法。

1.干法装柱

适用于凝胶颗粒直径≥30μm的刚性凝胶。装柱前必须将经过表面处理的硅胶，放入真空烘箱在65℃下烘3~4h，以便除去水分或溶剂，放在干燥器中待用，这样可以提高凝胶渗透色谱柱的柱效。

有关文献推荐用以下的步骤：

(1)用细金属丝上扎一块干净的布，依次用热的洗涤溶液、水和丙酮清洗内壁，以除去附着在柱管内的杂质，然后干燥；

(2)装好柱出口处的多孔滤板和密封柱头；

(3)将色谱柱放垂直，用漏斗加入约占柱体积5mm高的凝胶填料；

(4)把色谱柱以每秒2~3次的速度，在地板上轻叩80~次；

(5)轻轻擦柱内壁后，再将柱子垂直轻叩15~20s；

(6)另加同样体积的凝胶，再重复上述操作，直到色谱柱装满。在加凝胶时应慢慢旋转色谱柱；

(7)再轻轻地垂直叩色谱柱5s左右；

(8)从色谱柱上取走或补加一部分凝胶，使接头接上后不留死体积；

(9)将色请柱装在仪器上，用淋洗液淋洗至柱出口不再有气泡出现。

干法装柱一般多用自动装柱机来完成，自动装柱机如图5-3所示。凝胶装入上面的贮胶瓶内，随着柱上下振动，凝胶便缓慢填入柱内，振动马达的振动频率和振幅可任意调节。

2.湿法装柱

凝胶粒度直径＜30μm时，由于表面能的关系很容易发生凝聚，造成粒度分布变宽，从而会影响柱效。对于半刚性有机凝胶，由于在溶剂中有一定的溶胀，同时带有较大的静电，不能用干法装柱，而应用湿法装柱。

湿法装柱的方法很多，根据浆液溶剂的种类可分成平衡浆液法、非平衡浆液法、高粘度浆液法等。根据填装方法的不同，可分成动态浆液法和上方浆液法等。技术人员要根据填料种类、性质、使用条件选择合适的方法。不过，不管采用何种填装方法，若想得到理想的高效柱，必须满足下述条件：

(1)制备成的匀浆，其固定相粒子应在介质中高度分散并悬浮；

(2)匀浆配制稠度，即固定相与作为匀浆介质的溶剂比例，在匀浆罐容积允许范围内宜大一些为好；

(3)装填时的压力，根据固定相粒度、柱径、柱长等因素而定。对于常规柱控制在~kPa可得到满意结果。而粒度小于5um，柱径在2mm以下，柱长~mm时，压力需要提高到~kPa，甚至更高。

对于加压介质的选择，应尽可能接近或者等同于分析冲洗条件，这样可以省略溶剂活化和柱子性能调整等步骤。

湿法装柱主要应用于交联聚苯乙烯凝胶的填装，这里所介绍的湿法装柱实际上是指稳定匀浆装柱法：首先将有机胶浸泡在淋洗剂中约半小时，使其充分溶胀。装柱时将淋洗剂由色谱柱下端自下而上吸入柱内，使整个色谱柱充满溶剂，使其排尽空气并无气泡存在。接着将凝胶与淋洗剂一起，由高压泵打入柱内，并不断通入淋洗液使柱内凝胶装填致密，直到柱内胶面不再下降为止。

一般湿法装柱填的凝胶渗透色谱柱，其柱效率通常可达到0~理论塔板数。

3.等密度均浆装柱法

所谓等密度均浆装柱法，是指在装柱的过程中，必须寻找合适的混合溶剂，使它的密度和凝胶相一致，这样配成的凝胶浆液在转移到柱中时，就不会出现粒度的分层现象，以保证填装时凝胶颗粒按其直径大小分离的现象减小到最低程度。

用均浆法装柱，需要准备一套专用的装置：即一台能输出~kPa的高压泵，一般多用气动放大泵或者是并联的两台恒流泵；匀浆容器应具备耐高压的性能，可用不锈钢制成。另外泵和容器及柱之间的连接装置要具备在高压下不漏液的特性。

装柱成功的关键是避免凝胶在溶剂中沉淀分层，最好将凝胶填料加入混合溶剂中后，在超声波下进行处理制成稳定的均浆，制备好的匀浆装入均浆容器内，并将高压泵、容器、色谱柱连接好，并使柱子以很高的线性冲击速度灌满。正如表5-5所表示的那样，尽管有很多淤浆溶剂可以被采用，但是最广泛而又始终成功的技术大概还是高压密度平衡填装技术。

国外文献上用得最多的等密度均浆装柱法，是采用Majors的方法。这种方法的简单流程和装置如图5-4所示。如果以硅凝胶为例，寻找一种密度与硅凝胶相似(2.2g/cm3、颗粒直径10um)的等密度溶剂，配成浆糊状。Majors是采用重量比为60.6：39.4的四溴-乙烷(d=2.96g/cm3)与四氯乙烯(d=1.62g/cm3)等密度混合溶剂，精细调整两种溶剂比例，使硅胶粒子在30min内无移动现象为止。把此浆状液在超声波上脱气振荡2~3min，加入到图5-4的浆状液贮器中，小心地在其上加水，使其不要扰动浆状液层。盖好贮器，关闭三通阀，开高压泵使其升压至kPa，然后打开三通阀，使浆液迅猛地压入柱内，继续调节泵压使其保持在kPa，直至柱下端出现第一滴水。停泵，压力慢慢下降。最后依次分別将ml的干燥甲醇、异丙醇、丙醇、乙醚、二氯甲烷和氯仿用泵压过柱子，即可使用。

色谱柱装好后，用适当的溶剂逐步替换出装柱的混合溶剂，在全部替换完成后，即可接上仪器进行柱效的测定。柱效测定结果若合乎使用要求，则可把色谱柱留下待用。若柱效过低则需拆卸后重新装柱。

目前，已经有很多厂家向用户提供已经成品凝胶渗透色谱柱，如TOSOH、waters、shodex、Bio-rad等，这些不同品牌不同规格的柱子都有比较高的塔板数。